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WIWAM高通量植物表型成像系统—拟南芥和玉米转基因品系的功能分析

发布时间:2022-05-24 点击量:150

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保守的聚(ADP-核糖基)化(PAR)途径由三个遗传成分组成,它们是调节植物在胁迫下的能量稳态的潜在目标,目的是提高作物的产量稳定性并帮助确保粮食供应。我们通过在拟南芥和玉米 (Zea mays) 中使用转基因方法研究了PAR途径组分ADP-核糖/NADH 焦磷酸水解酶 (AtNUDX7) 在产量和轻度干旱胁迫中的作用。拟南芥AtNUDX7 cDNA分别通过花椰菜花叶病毒35S启动子和强启动子Brachypodium distachyon pBdEF1a在拟南芥和玉米中过表达。AtNUDX7在拟南芥中的过度表达改善了通过一种新的自动化方法测量的种子参数,加速了开花并降低了花序高度。这种有益特性的组合表明,拟南芥中的 AtNUDX7 过表达可能会通过在聚(ADP-核糖基)化能量稳态途径中提供 ATP 源来增强 ADP-核糖再循环步骤并维持能量水平。在自动化平台上分析了 AtNUDX7 基因高、中和低过表达水平的拟南芥和玉米品系,并在轻度干旱胁迫条件下确定了几个生长参数的抑制作用。数据显示,拟南芥AtNUDX7基因在拟南芥和玉米中不同水平的组成性过表达并没有提高对轻度干旱胁迫的耐受性,但下调AtNUDX7的表达确实提高了耐性,但在正常条件下以牺牲一般生长为代价。

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AtNUDX7 基因 (AT4G12720) 的全长 cDNA 在组成型花椰菜花叶病毒35S启动子控制下使用植物网关表达载体pK2GW7在拟南芥哥伦比亚 (Col-0) 种质中过表达,其携带新霉素磷酸转移酶 II (nptII) 选择标记基因(图1A)。花浸转化后,在含卡那霉素的培养基上以高密度平板选择 T0 转基因拟南芥植物,随后鉴定出具有单基因座纯合 T-DNA 插入的 T3 品系。p35S::AtNUDX7 系和 Col-0 对照植物的两周大T3幼苗用于定量 (q) PCR 表达分析。与 Col-0 对照相比,在 10 个独立的转基因 p35S::AtNUDX7 系中观察到 AtNUDX7 的高、中和低过表达水平,范围在 2 倍到 50 倍之间(图1B)。我们将其命名为 Atnudx7-1 (SALK-046441) 的功能丧失突变株系,在 Col-0 背景中在 AtNUDX7 基因的外显子 1 中插入了 T-DNA,验证了其 T-DNA 插入位置,纯合 T-DNA 插入,AtNUDX7 基因表达,并用作阴性对照(图 1C)。:种子产量;开花时间;水分亏缺;轻度干旱胁迫;组成型启动子。

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图1.AtNUDX7在拟南芥和玉米中的过表达

研究了两个高过表达(OE) 系 AtNUDX7_OE-At1 和 AtNUDX7_OE-At2、中等OE系AtNUDX7_OE-At3、低OE系AtNUDX7_OE-At5、Atnudx7-1 突变系(Salk -046441_1) 和 Col-0 控制线。呈现并总结了为p35S::AtNUDX7 OE 系、Atnudx7-1 突变系和 Col-0 对照系确定的种子产量和产量相关参数(图2,3)。与 Col-0 相比,高OE品系AtNUDX7_OEAt2 每株植物的总种子重量显着增加,每 10 个长角果的种子数(种子数)显着增加,种子质量和大小与 Col-0 相当。在中等 OE 品系 AtNUDX7_OE-At3 中可以看到种子数量、种子大小和每粒种子质量的显着增加,但在总种子重量中没有。通过称重完全成熟和干燥时收获的总种子来确定总种子重量,而成像用于确定种子数量和种子大小。如(材料和方法)所述计算每粒种子的质量。尽管 AtNUDX7_OE-At3 中的种子数量、种子大小和每粒种子的质量有所增加,但获取种子参数的方法的差异可能是总种子重量没有增加的原因。在低 OE 系 AtNUDX7_OE-At5 中,每株植物的总种子重量也显着增加,而种子数、种子大小和每粒种子质量保持不变(图2和3)。在重复实验中,在相同的三个AtNUDX7 OE_At2、AtNUDX7 OE_At3 和 AtNUDX7 OE_At5 品系中测量了改进的种子产量参数,但在高和中OE品系中比在低OE品系中更显著。

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图2.T3 p35S::AtNUDX7 拟南芥过表达系、Atnudx7-1突变系(SALK-046441_1) 和Col-0系的种子产量和开花时间参数

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图3. 四个T3 p35S:AtNUDX7过表达系和AtNUDX7-1突变系种子产量和开花时间参数的热图

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图4.在轻度干旱胁迫实验中测量的终点参数,以比较纯合pBdEF1a::AtNUDX7 过表达 T3 玉米品系、AtNUDX7_OE-Zm1、AtNUDX7_OE-Zm2 和 AtNUDX7_OEZm3 与 B104 对照玉米在充足浇水和缺水条件下

每天测量第4片叶子的长度,从植物的基部到叶尖,从外观到成熟,并用于确定叶子的生长速率。当第4片叶片停止生长时,测量其叶片重量、叶片和叶鞘重量、叶片宽度、总叶面积以及幼苗的鲜重和干重。分析了三个T3纯合玉米系AtNUDX7_OE-Zm1、AtNUDX7_OE-Zm2和AtNUDX7_OE-Zm3,分别具有AtNUDX7基因的高、中、低过表达水平,以及B104对照系。水分亏缺时,高表达和低表达玉米系AtNUDX7_OE-Zm1和AtNUDX7_OE-Zm3在所有测量参数中的减少百分比均高于B104野生型,尽管没有统计学意义。然而,在水分亏缺条件下中等过表达系AtNUDX7_OE-Zm2的叶片4叶片重量、叶片和叶鞘重量、叶片宽度和总叶面积比B104对照组分别减少15%、16%、9%和15%(图4),而AtNUDX7_OE-Zm2品系在水分亏缺条件下的植物生物量和植物干重减少与B104玉米对照没有统计学差异(图4)。此外,水分亏缺处理后,三个AtNUDX7过表达玉米系的叶4生长减少百分比与B104对照没有显著差异。在自动化平台上进行了三次重复的缺水试验;在前两个实验中,每个基因型的个体较少,大多数参数与B104玉米对照没有显著差异。


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